Hefe zum Altern beibringen Teil II

In meinem letzten Beitrag Ich erklärte, wie man eine Tüte mit 4 Hefesporen bekommt, von denen eine hoffentlich die beiden Mutationen hat, die ich in meinem neuen Hefestamm haben möchte. Jetzt kommt der wirklich knifflige Teil: Sie müssen diese Spore finden.

Bevor ich die Methode erkläre, muss man sich ein Bild davon machen, wie klein eine Hefezelle ist. Die durchschnittliche Hefezelle beträgt etwa 3 bis 4 Mikrometer. Der kleinste Abstand zwischen zwei Punkten, um sie mit bloßem Auge noch als zwei zu sehen, beträgt 0,1 mm, was etwa dem 300-fachen einer Hefezelle entspricht. Ein menschliches Haar ist im Durchschnitt zwischen 0,06 und 0,08 mm dick, was dem 20-fachen einer Hefezelle entspricht. Wenn Sie sich das Bild oben ansehen, das Hefezellen darstellt, die 1000x vergrößert sind, ist der gesamte Rahmen etwa so dick wie ein Haar.

OK, sie sind also wirklich klein und mit bloßem Auge nicht sichtbar, aber wir wollen eine einzelne Spore finden (die wieder kleiner ist als eine normale Zelle) und sie identifizieren. Die Methode, die wir dafür verwenden, heißt Mikromanipulation. Ein Mikromanipulator ist im Grunde ein Mikroskop mit einem Tisch (auf dem Sie die Platte mit Ihren Zellen fixieren), der in winzigen Schritten bewegt werden kann. Und es hat einen Hebel mit einer sehr dünnen Glasnadel, die durch einige Mechaniken auch in einem sehr kleinen Maßstab bewegt werden kann.

Mein Labor hat einen ziemlich coolen und modernen Mikromipulator, der einen Joystick hat, um die Bühne zu bewegen, und einen Computer, der Sie zu Positionen auf einem virtuellen Gitter auf Ihrer Platte bringt, wo Sie einzelne Zellen platzieren können.
Was Sie jetzt tun, ist, dass Sie durch ein Pflaster auf Ihrem Teller schauen, wo Sie einige Ihrer Zellen platziert haben. Sobald Sie eine Tasche mit 4 Sporen (die Tetrade genannt wird) gefunden haben, bewegen Sie die winzige Nadel sehr nahe daran. Einen Moment bevor die Nadel tatsächlich die Platte berühren würde, bildet sich ein Meniskus aus Wasser zwischen der Nadelspitze und der Platte, die den Tetraden aufschöpft und hoffentlich nichts anderes. Dann bewegen Sie sich in eine leere Position auf dem Gitter und indem Sie die Nadel bewegen und schütteln, während sie fast die Oberfläche berührt, versuchen Sie, eine dieser 4 Sporen zu deponieren. Dann gehst du zur nächsten Stelle und machst das noch einmal. So bekommst du am Ende einen Teller voller 4 Spots hintereinander, wo du einzelne Sporen deponiert hast. Wie das funktioniert, sehen Sie im folgenden Video.

Nachdem ich die Sortierung beendet hatte, stellte ich die Platte für ein oder zwei Tage auf 30 °C, um den Zellen Zeit zum Wachsen zu geben. Das Ergebnis sieht folgendermaßen aus:

Wie Sie sehen, sind nicht alle Zellen, die ich angelegt habe, gewachsen. Das ist ganz normal, denn nicht alle Sporen sind nach dem Eingriff lebensfähig. Auf der linken Seite war das Reservoir, wo ich viele Zellen platziert habe, um nach Tetraden zu suchen. Ich habe das mit einem sauberen Skalpell abgeschnitten, damit die Zellen den Rest des Tellers nicht überwachsen.

Im nächsten Schritt muss ich nun herausfinden, welche dieser Zellen wirklich von Sporen stammen (und haploid sind) und welche von ihnen eigentlich nur normale diploide Zellen sind, die versehentlich mit 3 Kumpels herumlagen und wie Tetraden aussahen. Um dies zu tun, verwenden Sie eine weitere nette Eigenschaft von Hefe. Wilde Hefe kann von einem Liter von Dingen leben und alles, was sie braucht (wie Aminosäuren und Basen für DNA), selbst entstehen lassen. Die Labstrains, die Sie normalerweise verwenden, haben jedoch einige Gene, die sie für diesen Knock-out benötigen. Dies bedeutet, dass Sie, um sie wachsen zu lassen, dem Medium einige Aminosäuren und andere Dinge hinzufügen müssen. Der Trick ist nun, dass die genetischen Merkmale, die ich hier gemeinsam züchten möchte, mit dem genetischen Code markiert sind, den der Laborstamm benötigt, um diese Amiosäuren selbst herzustellen. Das heißt, ich nehme diese Platte und stempele sie auf eine Platte, auf der dem Medium zwei spezielle Aminosäuren fehlen, nur die Zellen können wachsen, die beide genetischen Merkmale haben, die ich brauche. Dies wird als Selektion bezeichnet.

Das Problem dabei ist, dass die diploiden Zellen, die ich für Tetraden gehalten habe, auch beide Marker haben und auch wachsen können. Hier kann jedoch die Statistik helfen. Da ich immer alle 4 Zellen, die zusammen in einer Reihe waren und in einem Tetrad nur eine dieser 4 beide genetischen Marker haben kann, muss ich nun meine Selektionsplatte auf Reihen überprüfen, in denen nur eine der 4 Zellen gewachsen ist. Ein weiterer Test, den ich danach machen kann, ist zu sehen, ob sich die Zellen einer solchen Kolonie mit anderen haploiden Zellen beider Paarungstypen paaren. Diploide Zellen werden das nicht tun.

Die Ergebnisse sehen relativ vielversprechend aus, aber weitere Analysen zeigten, dass dies tatsächlich nicht funktioniert hat. Dies ist jedoch ein wichtiger Teil der Wissenschaft: Dinge funktionieren nicht. Nachdem ich dies ein paar Mal ausprobiert hatte, beschloss ich, zuerst einen anderen Weg zu versuchen, meinen Hefezellen das Altern beizubringen, der etwas eleganter ist und hoffentlich besser funktioniert: Ich werde das Gen für Telomerase ein- und ausschalten, damit ich es nach Belieben ein- und ausschalten kann. Ich werde das nächste Mal erklären, wie das funktioniert.