Hefe beibringen, wie normale Menschen zu altern Teil III

Im Beitrag "Hefe beibringen, um Teil II zu altern" habe ich erklärt, was ich zuerst versucht habe, meiner Hefe beizubringen, ihre Telomere bei jeder Zellteilung zu verkürzen. Ich habe Ihnen auch gesagt, dass es noch nicht funktioniert hat. Obwohl ich die Tretrad-Dissektion noch nicht ganz aufgegeben habe, habe ich mich entschieden, zuerst einen anderen Weg zu versuchen. Es wäre schon schön, meine fluoreszierend markierten Zellen mit einer ausgeschalteten Telomerase zu haben, aber es wäre viel cooler, die Telomerase nach Belieben ein- und ausschalten zu können.

Die Art und Weise, wie ich versuche, dies zu erreichen, wird Promoter Shuffle genannt. Wie Sie vielleicht wissen, werden Proteine (wie die Untereinheit der Telomerase, an der ich interessiert bin) im Genom durch einen festen Code kodiert, bei dem 3 Buchstaben (Codon genannt) in der DNA (Basen) in einen Buchstaben im Protein (Aminosäure) übersetzt werden. Dieser Code ist bekannt und verstanden. Alle Codes für Proteine beginnen mit dem gleichen Startcodon und enden mit einem von drei Stop-Codons. Um dieses Protein jedoch wirklich in der Zelle zu produzieren, muss es mehr geben. Flankiert werden muss das Gen von einem regulatorischen Code, der beeinflusst, ob und wie stark das kodierte Protein produziert wird. Am wichtigsten dafür ist die sogenannte Promoter-Region. Dies ist der Code direkt vor dem Startcodon. Es ist normalerweise zwischen 50 und ein paar hundert Basen lang. Ihr Code ist viel weniger verstanden als der für das Protein. Es gibt starke und schwache Promotoren, Promotoren, die immer aktiv sind und Promotoren, die bei bestimmten Reizen aus- oder eingeschaltet werden.

Da ich die Telomerase umschaltbar machen möchte, nehme ich den genetischen Code für eine ihrer Untereinheiten und tausche einen Teil des Codes vor seinem Startcodon gegen etwas anderes aus. Es gibt eine Handvoll gängiger schaltbarer Promotoren in Hefe, die gut beschrieben sind, aber die meisten von ihnen haben einige Nachteile. Ich habe eine relativ neu identifizierte identifiziert, von der ich hoffe, dass sie eine gute Wahl sein wird.

Es ist der Promotor des Gens DDI2, der normalerweise fast inaktiv ist, aber seine Aktivität um mehr als das 1000-fache erhöht, wenn die Zellen mit dem chemischen Cyanamid inkubiert werden. In der Konzentration, in der es hier verwendet wird, hat Cyanamid fast keine Wirkung auf die Hefezellen.

Der Austausch von Code im Hefegenom ist glücklicherweise nicht allzu kompliziert. Hefe enthält ziemlich leicht genetisches Material, das Sie füttern, wenn eine Dehnung am Anfang und Ende des eingefügten Codes mit dem Code im Genom übereinstimmt. Dieser Prozess wird als Rekombination bezeichnet. Rekombination ist auch der Prozess, der Kinder einzigartig macht, anstatt Kopien ihrer Eltern, weil es zufällig das genetische Material Ihrer Eltern mischt, das an Ihre Kinder weitergegeben wird.

Ich brauche also einen DNA-Abschnitt, der die 500 Basen vor dem Startcodon von DDI2 mit 50 Basen an beiden Enden aus dem Bereich vor dem Startcodon der Telomerase-Untereinheit enthält. Ich habe viel darüber nachgedacht, wie ich das selbst bauen kann, aber es wäre eine Menge Arbeit gewesen. Dann dachte ich an die Zeitung, in der ich zum ersten Mal über den DDI2-Promoter las. In dem Nature-Artikel "Fine-tuning the expression of target genes using a DDI2 promoter gene switch in angehender Hefe" charakterisierten Professor Yu Fu von der Chinesischen Akademie der Wissenschaften und Kollegen den Promotor und erklärten, wie sie ihn an genomischen Stellen integrierten.

Also schrieb ich einfach eine E-Mail an Professor Fu und fragte, ob ich etwas von dem Material bekommen könnte, das sie benutzten. Er antwortete tatsächlich innerhalb eines Tages und sagte, dass er mir gerne helfen würde. Er schickte mir den Code des Promoters, ohne eine Gegenleistung zu erwarten. Das ist eine großartige Sache an der Wissenschaftsgemeinschaft. Die meisten Leute teilen gerne und sind wirklich nett, wenn Sie Interesse an ihrer Arbeit zeigen.

Alles, was ich jetzt tun muss, ist, die Code-Strecken an den Enden hinzuzufügen, die das Ziel bestimmen, wo ich es integrieren möchte. Ich mache das mit einer PCR, die ich in meinem nächsten Artikel erklären werde.