Was ist eine PCR?

Und wie funktioniert sie?

Was ich machen will

Im letzten Artikel habe ich dank Prof. Yu Fu ein Stück DNA bekommen, dass ich als Schablone für meine Arbeit nutzen kann. Auf diesem DNA-Ring, den man Plasmid nennt, sind verschiedene Funktionen eingebaut, dank derer er sich in Hefe und E. coli Bakterien halten und vermehren kann. Was mich aber vor allem Interessiert ist die „Nutzlast, die er enthält“: Ein Promoter, der die Funktion von Genen steuert. Was ich damit will erkläre ich in einem älteren Artikel, den ich aber bisher noch nicht übersetzt habe (Ich mache das bestimmt noch und es gibt schon eine etwas holprige automatische Übersetzung).

Kurz gesagt ich möchte die original Steuerung von einem Gen (Telomerase) austauschen gegen eine, die ich an und aus schalten kann. Das heißt, ich möchte, dass ein Stück der Sequenz von dem DNA-Ring (der Promoter) eine bestimmte Stelle des Genoms (also der Erbinformation) der Hefe ersetzt. Dazu muss ich zwei Sachen erledigen bevor ich die Information in die Hefe bringen kann:

Ich muss aus dem DNA-Ring, das Stück dass ich brauche als lineares DNA-Fragment (nicht mehr Ring) rausholen und ich muss an dieses Fragment an beiden Enden Stücke anhängen, die genau den Stellen im Genom der Hefe entsprechen an denen ich es einfügen will.

Was ist eine PCR?

Ich kann beides in einem Schritt mit einer Technik namens Polymerase-Kettenreaktion oder PCR machen. Aber was ist eine PCR?

Eine PCR ist eine Methode, um DNA zu produzieren, ohne lebende Zellen dafür zu benutzen. Es ist so etwas wie eine molekulare Kopiermaschine. Die Hauptbestandteile für eine PCR sind ein Enzym namens DNA-Polymerase (der eigentliche Kopierer), dNTPs (die die Bausteine der DNA), eine DNA-Vorlage (oder Template), aus der ich kopieren möchte und Primer. Primer sind kleine DNA-Stückchen (normalerweise etwa 20-25 Basen lang), die den DNA-Abschnitt definieren, der kopiert wird. Der Vorwärtsprimer (das Startsignal) ist komplementär zu der Sequenz, bei der ich die Kopie starten möchte und der Rückwärtsprimer ist identisch mit der Sequenz, an der ich die Kopie stoppen möchte.

Wie funktioniert eine PCR? Die drei Schritte

Das Bild oben stammt aus dem Wikipedia-Artikel über PCR, der die Methode auch sehr gut im Detail erklärt. Im ersten Schritt muss die DNA für das Kopieren zugänglich gemacht werden, indem sie erhitzt wird bis sich die typische Doppelstrangstruktur in zwei Einzelstränge aufspaltet. Dazu erhitzt man sie auf etwa 95 °C.

Als zweites kühlt man die DNA auf die Annealing-Temperatur ab. Das ist die Temperatur, bei der die Primer sich an die Vorlage anheften können. Sie ist also etwas kälter als die Schmelztemperatur der Primer und hängt von der länge und Zusammensetzung der Primer ab. Meistens liegt sie zwischen 50 und 60 °C.

Im dritten Schritt muss die DNA-Polymerase gestartet werden. Die meisten Polymerasen, die man für PCR benutzt arbeiten am besten um die 72 °C. Das klingt nach einer sehr hohen Temperatur für ein Enzym und das ist es auch. Der Trick ist, dass die Polymerase aus dem Bakterium Thermophilus Aquaticus (oder anderen hitzliebenden Bakterien) stammt, das um hydrothermale Quellen herum lebt, die Wasser, Rauch, Säure und anderes Zeug bei Temperaturen von mehr als 100 ° C spucken. Deshalb sind ihre Enzyme optimiert, um unter extrem heißen und unangenehmen Bedingungen zu arbeiten.

Jetzt wiederholst du diese drei Schritte immer und immer wieder und mit jeder Wiederholung verdoppelt sich die Anzahl deiner Kopien des DNA-Stücks, das zwischen den beiden Primern liegt. Das bedeutet, dass Sie ein exponentielles Wachstum von 1 zu 2 zu 4 zu 8 zu 16 haben … auf etwas mehr als eine Million nach 20 Zyklen auf etwas mehr als eine Milliarde nach 30 Zyklen. So erzeugt man in recht kurzer Zeit (normalerweise 1 bis 4 Stunden) eine Menge identischer DNA.

Die Maschine, die die Temperatur programmiert einstellt, heißt Thermocycler und sieht recht unspektakulär aus.

Zusatzfunktionen des Kopierers

Dies erklärt, wie ich den DNA-Abschnitt aus dem Plasmid kopiere. Aber ich wollte auch eine Sequenz an den Enden hinzufügen. Das ist eigentlich ganz einfach. Ich füge die Sequenz einfach zu den Primern hinzu, weil sie der Anfang und das Ende meiner neu kopierten DNA-Konstrukte werden.

Jetzt fragt Ihr euch vielleicht, wie diese Primer bekomme? So wie die meisten Dinge heute. Ich bestelle sie online. Es gibt Unternehmen, die sich auf die Herstellung von kundenspezifischer DNA spezialisiert haben. Grundsätzlich könnte ich mir auch die ganze Arbeit sparen und einfach mein ganzes Konstrukt online bestellen, aber das ist immer noch ziemlich teuer. Während meine außergewöhnlich langen Primer (Primer + Sequenz sind etwa 120 Basen lang) etwas zwischen 100 und 150 € kosten, würde mein gesamtes 2500 Basen langes Konstrukt über 1.000 € kosten. Das ist immer noch ein ziemlicher Unterschied, aber es wird billiger und in ein paar Jahren werden Biologen wahrscheinlich viel mehr DNA bestellen, als sie mit molekularen Techniken wie PCR und Klonen zu erzeugen.

Wie überprüfe ich ob es geklappt hat?

Jetzt, wo ich mein PCR-Produkt habe, möchte ich überprüfen, ob es auch das richtige ist. Der einfachste Weg ist den ganzen PCR-Ansatz in ein Gel zu packen, das kurze DNA schneller passieren lässt als lange DNA. Dann legt man eine Spannung an und die negativ geladene DNA wandert in Richtung der positiven Elektrode und teilt sich nach Größe auf. Wenn man außerdem einen Marker in das Gel packt, der DNA-Stücke in bekannter Größe und einen Stoff enthält, die DNA unter UV-Licht sichtbar macht (Ethidiumbromid), kann man sehen, welche Größe unsere kopierten Fragmente haben. Das gibt uns normalerweise eine gute Vorstellung davon, ob das Experiment wie erwartet gelaufen ist.

Klappt das immer?

Ich habe das alles gemacht und beim ersten Versuch war das Ergebnis überhaupt keine sichtbare DNA. Dann habe ich ein paar Parameter verändert und es nochmal versucht. Diesmal war zumindest eine sehr dünne Bande zu sehen, wo ich sie erwartet hatte und ein paar andere, wo sie nicht sein sollten. Also habe ich noch ein paar Parameter geändert und beim dritten Versuch bekam ich dieses wunderbare Bild von einem Gel mit einer starken Bande genau an der Position, an der ich es erwartet hatte.

Das hat mich ziemlich glücklich gemacht, aber jetzt muss ich etwas damit anfangen. Ich will diese DNA in eine Hefezelle stecken und in das Genom integrieren. Das wird Genmanipulation oder Transformation genannt und ist auch ziemlich schwierig.