Wie funktioniert Genmanipulation?

Der nächste Schritt um Hefe das Altern beizubringen

Leicht dramatisierte Darstellung von mir mit Pipette, Petrischale und Blitzen
Foto von mir, wie ich die Gene einer wehrlosen Hefe verändere, eigene Arbeit

Im letzten Artikel hatte ich am Ende ein DNA-Fragment, das ich mit einer PCR hergestellt habe. Jetzt muss ich diese DNA in meine Hefezellen bekommen, um ihnen beizubringen, wie normale Menschen zu altern. Ich muss Sie also genetisch manipulieren. Das nennt man auch Transformation. Aber wie funktioniert Genmanipulation?

Wie funktioniert Genmanipulation?

Es gibt verschiedene Transformationstechniken, aber am häufigsten sind Elektroporation und chemische Transformation. Man kann emotionale Debatten auslösen, wenn man fragt, was besser ist. Die häufigere und im Allgemeinen etwas einfachere ist aber die chemische Transformation. Das ist auch die Methode, die ich für meine Hefe gewählt habe.

Hindernisse für DNA auf dem Weg in die Zelle

Was bei der Transformation mechanisch genau passiert ist nicht vollständig verstanden. Die Hauptidee ist, dass die DNA, die ich in die Zelle bringen will, die Barrieren überwinden muss, die Zellen vor ihrer Umgebung schützen. Diese Barrieren sind die Zellwand (für alle außer tierischen Zellen, die keine haben) und die Zellmembran. Die Hauptaufgabe der Zellwand ist die mechanische Stabilität. Du kannst sie Dir wie einen Stahlrahmen vorstellen, der verhindert, dass die Membran zu stark anschwillt und platzt. Die Zellmembran kannst du dir wie eine Wasserbombe vorstellen. Auf molekularer Ebene ist es ein relativ breites Netz, also keine physikalische Barriere für die DNA-Moleküle. Problematisch ist aber, dass es elektrisch geladen ist. DNA ist negativ geladen und würde von den meist ebenfalls negativ geladenen Molekülen in der Zellwand abgestoßen werden. Dieses Hindernis wird überwunden, indem positiv geladene Ionen hinzugefügt werden, die die Ladungen der Zellwand neutralisieren und es der DNA ermöglichen, sich der Zellmembran zu nähern.

Darstellung einer Hefezelle bei der Abspaltung einer Tochterzelle. Zu sehen sind die wichtigsten Organellen. Die Zellmembran und Zellwand sind an einer Stelle vergrößert um den genauen Aufbau darzustellen. Man sieht die Lipiddoppelschicht der Zellmembran und das grobe Netz aus Proteinen und Zuckern, dass die Zellwand bildet.
Schematische Struktur einer knospenden Hefezelle mit besonderem Fokus auf Membran und Zellwand rechts, Giulia Coradello, 2021

Die Zellmembran

Aber dann gibt es noch ein anderes Problem: Die Zellmembran. Die Membran ist eine Doppelschicht aus Lipiden, also Fettmolekülen, die einen polaren Kopf und einen ungeladenen Schwanz haben. Diese Struktur ist so etwas wie eine zweidimensionale Flüssigkeit. Sie ist relativ elastisch und ermöglicht es ungeladenen Molekülen, die nicht zu groß sind, relativ frei durchzuschlüpfen. Dazu gehört zum Beispiel Wasser. Da DNA riesig und geladen ist, wird sie normalerweise nicht einfach durchkommen. Um diese Barriere zu überwinden, musst ich die Hefe ein wenig quälen (*böses Wissenschaftlerlachen). Ich packe Sie plötzlichen von Raumtemperatur auf 42 °C. Klingt nicht so schlimm, aber Hefe mag es am liebsten zwischen 20 und 30 ° C. Temperaturen über 40 ° C beginnen sie langsam zu töten. Es wird angenommen, dass dies Druckunterschiede zwischen der heißen Außenseite und der Kühle im Inneren der Zelle aufbaut, die durch die Bildung von Poren in der Membran ausgeglichen werden. Durch diese Poren kann nun die DNA in die Zelle eindringen.

Die letzte Verteidigungslinie

Die letzte Verteidigungslinie der Zelle sind Enzyme, die DNA essen. Um sie zu überwinden füge ich etwas Träger-DNA hinzu, die zuerst gegessen wird und so die DNA schützt, die ich in die Zellen bekommen möchten. Als Träger-DNA verwendet man normalerweise Lachssperma, das man kocht und dann der Mischung hinzufügt. Wenn du also Molekularbiologen über das Kochen von Sperma sprechen hörst, ist es wahrscheinlich nicht so seltsam, wie es klingt.

Wie was passiert mit der fremden DNA in der Zelle?

Nachdem wir die Abwehr überwunden haben, haben wir jetzt viele tote Zellen, viele die nichts oder nur die Träger-DNA aufgenommen haben, aber wir haben hoffentlich auch einige, die die DNA haben, die wir einschleusen wollen. Was mit dieser DNA passiert, hängt von ihrer Form ab. Wenn es sich um einen geschlossenen Kreis handelt und einige spezielle Signale in den Code enthalten sind, wird er in der Zelle behalten und in die Tochterzellen kopiert, wenn sich die Zelle teilt. Dies wird als Plasmid bezeichnet und ist gut, wenn du Gene nur vorübergehender einführen möchtest, ohne das Genom dauerhaft zu verändern. Wenn die DNA (wie in meinem Fall) ein lineares offenes Molekül ist, das durch eine PCR produziert wurde und Enden hat, die einer Sequenz im Genom der Hefe ähneln, kann sie in den Zellkern gelangen, wo das Genom aufbewahrt wird. Dort kann es einspringen, während die Zelle Ihr Genom verdoppelt und dauerhaft in das Genom integriert werden. Das nennt man Rekombination. Bei Hefe funktioniert das Ziemlich gut, aber trotzdem nur etwas bei einer von einer Million Zellen.

Die richtige Finden mit dem gläsernen Schuh

Jetzt müssen wir also etwas machen, was ja bekanntlich für viele Wissenschaftler schwer ist: Die richtige finden. Zum Glück haben wir etwas wie einen gläsernen Schuh, der nur den Zellen passt, bei denen die Integration, also die Genmanipulation geklappt hat.

Man nennt das Selektion. Wir säen die Zellen auf ein Medium, in dem nur die Zellen wachsen können, die unsere DNA aufgenommen und integriert haben, also denen der Schuh passt. Um das zu erreichen, fügt man der DNA, die man einschleust einen Marker hinzu. Das ist ein Gen, das die Zellen entweder resistent gegen etwas macht, das für die anderen giftig ist oder das sie von einer Nahrungsquelle leben lässt, die die anderen nicht verwenden können. Ich habe Zellen verwendet, die normalerweise Uracil (das ein Teil der DNA ist) nicht selbst herstellen können, so dass sie nicht auf einem Medium wachsen können, auf dem es kein Uracil gibt. Sie können auf diesem Medium nur wachsen, wenn sie mein Konstrukt eingebaut haben, das ein Gen enthält, das ihnen hilft, ihr eigenes Uracil herzustellen.

Das Problem ist, dass diese Integration sehr selten ist. Du beginnst mit einer riesigen Menge an Zellen, transformierst sie alle, packst sie auf die Auswahlplatte und bekommst manchmal nichts, manchmal ein oder zwei Kolonien, aber manchmal, wenn du Glück hast, bekommst du auch so etwas wie 100.

Wie funktioniert Genmanipulation? Agarplatten auf die die transformierte Hefe ausgesät wurde. Auf einigen sind zwischen 1 und 100 weiße Punkte zu erkennen. Das sind Kolonien der erfolgreich genmanipulierten Hefen.
Wie Selektionsplatten der verschiedenen transformierten Stämme und eine Kontrolle, die nicht transformiert wurde, eigene Arbeit

Der letzte Schritt, wieder eine PCR

Um zu überprüfen, ob das Konstrukt wirklich dort integriert ist, wo ich es mir erhofft habe, brauche ich jetzt eine weitere PCR. Ich habe Primer gewählt, die normalerweise ein kurzes DNA-Fragment aus der Region produzieren, in die ich mein Konstrukt integrieren möchte. Wenn es erfolgreich integriert wird, wird das Fragment länger, was ich in einer Gelelektrophorese, die die Fragmente nach der Größe auftrennt, sehen kann. Und das ist es, was ich gerade tue. Ich gebe bald ein Update, wenn ich endlich meine alternde Hefe gefunden habe.

Wie funktioniert Genmanipulation? Man nimmt ein Stück DNA, bringt es dazu sich ganz nah an die Zellen zu kuscheln, macht sie heiß und sucht dann mit einem gläsernen Schuh die richtige. Wer hätte gedacht, dass Genmanipulation so romantisch ist.

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