Zeig mir deine Telomere und ich sage dir wie alt du wirst

Mein Promotionsprojekt einfach erklärt

Dieser Artikel basiert auf einem Poster, dass ich für ein Forschungsforum an der HTW Berlin im Oktober 2021 präsentiert habe. Das Poster ist unter DOI: 10.13140/RG.2.2.26595.43048 verfügbar.

Was ist so spannend an Telomeren?

Darstellung eines Chromosoms mit gefärbten Enden (Telomere) und Flussdiagramm von deren Einfluss auf die Zelle (siehe Untertitel)
Telomere verkürzen sich bei jeder Zellteilung. Bei kritischer Verkürzung wird die Zelle Seneszent, was zu Alterung von Organen führt. In Keimbahn-, Stamm- und Tumorzellen wird die Länge der Telomere durch Telomerase stabilisiert.

Telomere sind sowohl für das Altern, als auch für Krebs relevant. Medikamente die sie verlängern, könnten das Altern verzögern. Medikamente die sie verkürzen, könnten in der Krebstherapie eingesetzt werden.

Projektidee

Entwicklung neuer Medikamente, die die Länge und Dynamik von Telomeren beeinflusst, benötigt Systeme um nach diesen zu Suchen. In diesen muss der Einfluss von tausenden Stoffen auf Telomere parallel und einfach untersuchbar sein.

Idee: Ein hochdurchsatzfähiges System, dass durch optische Signale eine Abschätzung der Telomerlängen von lebenden Hefezellen erlaubt. Dazu sollen Proteine, die natürlicher Weise an Telomere binden fluoreszent und/oder lumineszent markiert werden.

Problem: Hefe hält mittels Telomerase ihre Telomere konstant. Es wird also neben der Markierung noch eine Möglichkeit integriert, die Telomerase der Hefe gezielt aus- und einzuschalten.

Markierung Telomer-assoziierter Proteine

Schematische Darstellung von Hefe-Telomeren und der mit ihnen assoziierten Proteinkomplexe
Schematische Darstellung von Hefe-Telomeren und der mit ihnen assoziierten Proteinkomplexe: Am wichtigsten sind hier die Komplexe von Rap1 mit Rif1/Rif2. Die möglichen Markierungsstellen sind durch grüne Glühbirnen dargestellt.

Methode zur Markierung

Die Markierung erfolgt durch genomische Markierung der Zielproteine (RAP1, RIF1 und RIF2), durch Fusion mit Reporterproteinen. Dazu wird der genetische Code des Reporters mittels Transformation und Rekombination an den Code für das Zielprotein im Genom angefügt.

Verschiedene Methoden der Markierung: Fluoreszenz, Quenching, FRET (Förster-Resonanz-Energietransfer), BRET (Biolumineszenz-Resonanz-Energietransfer)
Möglichkeiten zur Markierung der Proteine: Fluoreszenzmarker leuchten, wenn sie angestrahlt werden in einer anderen (rotverschobenen) Farbe, biolumineszente Marker leuchten selbst durch Umsetzung eines Substrats, zwei gleiche Fluoreszenzmarker reduzieren ihre Fluoreszenz, wenn sie sich nahe kommen (Quenching), ein Fluoreszenzmarker kann seine Energie auf einen anderen übertragen, der dann in einer anderen (noch weiter rot verschobenen) Farbe leuchtet (FRET), ein Lumineszenzmarker kann seine Energie auf einen Fluoreszenzmarker übertragen, der dann in einer anderen Farbe leuchtet (BRET), diese Methoden erlauben Abstandsmessung auf atomarer Ebene

Methoden zum Ein-/Ausschalten der Telomerase

Um die Telomerase schaltbar zu machen wird der Promoter eines der Gene, die gemeinsam die Telomerase bilden ausgetauscht. Ein Promoter ist eine regulatorische Sequenz neben dem eigentlichen Gen, also dem Bauplan eines Proteins. Er steuert, wie und wann das codierte Protein produziert wird.

Der natürliche Promoter des Gens EST2, das einen der Bestandteile der Telomerase der Hefe bildet, wird gegen den Promoter des Gens DDI2 ausgetauscht. Während Telomerase in Hefe immer aktiv ist, wird das Gen DDI2 nur bei bestimmten chemischen Reizen aktiviert. Bei erfolgreichem Austausch des Promoters ist die Telomerase inaktiv, kann aber durch Zugabe von geringen Mengen Cyanamid aktiviert werden.

Eine Möglichkeit dies zu erreichen ist, den Promoter direkt im Genom der Hefe über Rekombination auszutauschen.

Eine andere etwas einfachere Methode wäre es, das Gen im Genom der Hefe zu zerstören (knock-out) und eine funktionelle Version mit dem ausgetauschten Promoter auf einem künstlichen Chromosom (Plasmid) in die Zelle einzubringen.

Stand der Arbeiten nach Jahr 1 von 4

Es stehen Bibliotheken von Hefestämmen mit GFP-markierten Proteinen zur Verfügung. Mit diesen wurden erste Vorversuche zur Etablierung der Messung durchgeführt.

Es wurde ein DNA-Konstrukt entworfen und produziert, das es ermöglichen sollte den Promoter des Gens EST2 auszutauschen. Das Konstrukt wurde in Stämme mit verschiedenen GFP-Markierungen transformiert.

Aktuell werden transformierte Kolonien daraufhin untersucht ob und wo das Konstrukt im Genom integriert ist. Es wird außerdem auf Proteinebene überprüft, ob die Steuerung funktioniert.

Parallel wird ein Plasmid zur Komplementierung eines EST2-knock-out und eine Strategie zu dessen Konstruktion entworfen.

Karte des benutzen Konstrukts zum Austausch des Promoters
Karte des Fragments zum Promoter-Austausch mit PCR-Primern, eigene Arbeit, SnapGene
Auswertung der Fluoreszenzmessung von Hefezellen mit verschiedenen GFP-markierten Proteinen, deren Telomere durch Kultur in ethanolhaltigem Medium verlängert wurden, eigene Arbeit
Hefekolonien, die als weiße Punkte auf einem durchsichtigen Medium in einer Petrischale zu sehen sind
Wachstum transformierter Kolonien auf selektivem Nährmedium, eigene Arbeit
Banden auf einem Agarosegel, die fluoreszenzmarkierte DNA-Stücke verschiedener Größen zeigen
Fluoreszenzaufnahme von Ethidiumbromid gefärbter DNA in einem Agarosegel, Ergebnis einer PCR zur Überprüfung der Insertion meines Konstrukts im Genom der Hefe, eigene Arbeit
Fluoreszenzmikroskopieaufnahme von Hefen, die das Grünfluoeszierende Protein (GfP) produzieren
Fluoreszenzmikroskopische Aufnahme von Hefezellen, die ein Fusionsprotein aus GFP und RAP1 exprimieren, eigene Arbeit

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