Felix

Was ist CRISPR/Cas?

| Veröffentlicht am | Keine Kommentare |

Was ist CRISPR/Cas, warum ist es so revolutionär und kann damit jeder einfach das Genom von allem verändern? Über ein tolles Werkzeug in der Gentechnik, was es kann und was nicht.

Als im Jahr 2020 der Nobelpreis für Chemie an Jennifer Doudna und Emmanuelle Charpentier ging überraschte das eigentlich niemanden. Schon als ich Emmanuelle Charpentier auf einer Preisverleihung 2016 gesehen habe, war den meisten klar, dass das Nobelkomitee nur auf die Einigung in einem Patentstreit wartet um die beiden zu nominieren. Die Arbeit, die die Wissenschaftlerinnen weltweit bekannt gemacht hat, ist der Artikel „A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity“ der 2012 in der Zeitschrift Science erschien. Darin wird erstmals die Nutzung eines Bakteriellen Abwehrsystems, das heute als CRISPR/Cas bekannt ist, in der Gentechnik beschrieben.

Emmanuelle Charpentier auf dem Podium bei einer Preisverleihung
Emmanuelle Charpentier, eine der Entwicklerinnen von CRISPR/Cas bei der Verleihung des Gairdner Award in der Kanadischen Botschaft Berlin am 06.09.2016, eigenes Foto

Was ist CRISPR/Cas

Doch was ist CRISPR/Cas und warum ist es so ein riesiger Sprung in der Gentechnik? CRISPR beschreibt bestimmte sich wiederholende Motive, die in den Genomen verschiedenster Bakterien gefunden wurden. In den frühen 2000er Jahren entdeckte man, dass diese Motive im Zusammenhang mit einem Abwehrmechanismus dieser Bakterien stehen, der sie vor Virenangriffen schützt. Befällt ein Virus eine Zelle, injiziert es sein Erbgut und programmiert damit die Zelle für seine Zwecke um. Die Zelle produziert nach diesem Bauplan jetzt neue Viren und zerstört sich damit in den meisten Fällen selbst. Viren sind für Bakterien, die ja keine spezialisierten Immunzellen wie wir haben, eine sehr große Bedrohung und sie haben viele Strategien entwickelt um dieser Gefahr zu begegnen.

Eins der am weitesten verbreiteten solcher Abwehrsysteme ist CRISPR/Cas. Bestimmte CRISPR assoziierte (Cas) Proteine binden die durch Viren eingeschleuste DNA, schneiden kleine Stücke davon heraus und bauen sie zwischen Wiederholungssequenzen ins Genom des Bakteriums ein (CRISPR). Wird das Bakterium erneut von diesem oder einem ähnlichen Virus befallen, kann ein anderes Cas Protein jetzt mit Hilfe dieser gespeicherten Erkennungssequenzen die Viren-DNA sofort erkennen und sie zerschneiden, bevor sie sich vermehren kann.

Revolution in der Gentechnik

Genau diesen Teil der erlernten Immunantwort der Bakterien, das programmierbare Schneiden von DNA-Sequenzen, haben die beiden Nobelpreisträgerinnen entschlüsselt und eine Methode entwickelt, diese Programmierung beliebig zu ändern. Der Trick ist, dass das Cas-Protein DNA schneidet, deren Sequenz einer RNA-Sequenz entspricht, mit der es verbunden ist. Diese sogenannte guide RNA kann man relativ einfach Herstellen und so das exakte Ziel festlegen an dem DNA geschnitten werden soll.

Guide RNA and CRISPR-associated protein Cas9 (white) from Staphylococcus aureus, CC von Thomas Splettstoesser (www.scistyle.com)

Da diese Zielprogrammierung sehr genau ist, kann diese Genschere, im Gegensatz zu den Werkzeugen, die der Gentechnik vorher zur Verfügung standen, in einer lebenden Zelle deren Erbgut an genau einer Stelle schneiden. Inzwischen wurden noch weitere ähnlich exakte Genscheren entwickelt, die allerdings bei weitem nicht so unkompliziert programmierbar sind.

Schnitte oder Brüche in DNA entstehen häufig auch natürlich und deshalb gibt es Reparaturmechanismen, die diese wieder schließen. Die einfachste Art die beiden Enden eines zerschnittenen DNA-Strangs wieder zu verbinden ist die nicht-homologe Endreparatur. Bei dieser werden zwei DNA-Enden ohne Rücksicht auf Verluste verknüpft. Das funktioniert leider nicht perfekt und meistens gehen dabei ein paar einzelne Buchstaben (Basenpaare) aus der DNA-Sequenz verloren oder es werden ein paar neue eingefügt.

Kleiner Fehler im Code, große Wirkung – der Knock-out

Wenn es sich bei dieser Sequenz um ein Gen, also den Bauplan für ein Protein handelt, ist das für diesen Bauplan in zwei von drei Fällen verheerend. Der Grund dafür liegt in der Sprache der DNA, dem Code. Immer drei Buchstaben (Basen) in der DNA bilden ein Wort. Die Wörter sind Aminosäuren, also die Grundbausteine der Proteine, welche wiederum der ganze Satz sind, der in einem Gen steht.

Das Problem an dieser Art zu schreiben ist, dass es keine Leerzeichen gibt, die Festlegen, wo ein Wort aufhört und das nächste anfängt. Das führt dazu, dass es drei Möglichkeiten gibt wo man anfängt zu lesen, die zu komplett unterschiedlichen Wörtern und Sätzen führen. Der Start, an dem angefangen wird zu lesen, also die DNA in ein Protein zu übersetzen, wird durch ein speziellen Wort aus drei Buchstaben, das Start-Codon festgelegt. Das Ende wird auch wieder durch eine spezielles Wort, eines von drei möglichen Stopp-Codons bestimmt.

Diese Art des Codes bedeutet, dass wenn ein einzelner oder zwei Buchstaben hinzugefügt oder weggelassen werden, sich die gesamte Bedeutung des restlichen Satzes ändert, weil sich das Leseraster verschiebt. Damit wird das Protein, dass von dem Gen codiert wird, nicht mehr korrekt hergestellt wird. Es wird also ausgeschaltet. In der Gentechnik nennt man das Knock-out.

Einfügen von neuem Code – Knock-in

Wenn man nicht nur ein Gen kaputt machen möchte, sondern neue Informationen einfügen will, macht man sich die andere Reparaturmethode der Zelle zunutze, die Homologe Reparatur. Für die Zelle ist das eigentlich die bessere Methode Brüche in der DNA zu reparieren, da sie weniger Fehler macht. Wenn der Zelle ein Stück DNA zur Verfügung steht, das die gleiche (oder eine ähnliche) Sequenz hat wie die Stücke vor und nach dem Schnitt, baut die Zelle dieses Stück ein und tauscht das kaputte Stück aus.

Über diese Methode kann man eine neue Sequenz ein das Genom einer Zelle einbauen. Wie das geht habe ich hier erklärt.

Bei beiden Methoden wird die Sequenz, die ursprünglich vom Cas Protein erkannt und geschnitten wurde zerstört und das Genom wird nach der Reparatur nicht wieder geschnitten.

Anwendung von Medizin bis Landwirtschaft

Was kann man nun mit CRISPR/Cas machen? Indem es damit deutlich vereinfacht wurde gezielte Veränderungen am Genom verschiedenster Organismen vorzunehmen, wurde die Entwicklung in der Gentechnik extrem beschleunigt: In der Forschung kann die Funktion eines Gens schnell untersucht werden, indem es ausgeschaltet wird. In der Landwirtschaft können Pflanzen resistenter gegen Dürre und Schädlinge gemacht werden indem man ihnen entsprechende Resistenzen aus anderen Pflanzen überträgt. Auch erste genmodifizierte Tiere werden entwickelt, wie zum Beispiel ein Wels, der mit Hilfe eines Gens aus dem Alligator resistenter gegen Krankheiten werden soll.

In der Medizin werden wohl noch 2023 die ersten Gentherapien regulär Patienten heilen. Die ersten Therapien werden größtenteils außerhalb des Körpers durchgeführt. Dazu werden zum Beispiel Blutstammzellen von Patienten mit einer angeborenen Sichelzellenanemie isoliert, ein defektes Gen repariert und diese Stammzellen dann dem Patienten wieder injiziert. Diese können dann im Patienten funktionierende rote Blutkörperchen bilden, wozu sie vorher nicht im Stande waren.

Ablauf der Herstellung von CAR-T-Zellen
Prinzip und Methode der Herstellung von CAR-T-Zellen, Michels, A., Hartmann, J. & Buchholz, C.J., CC BY 4.0, via Wikimedia Commons

Eine andere wichtige Gruppe von Gentherapien, die ähnlich funktionieren sind die CAR-T-Zellen. Das sind Patienteneigene Immunzellen, denen mittels eines Gens für einen speziellen Rezeptor beigebracht wurde Krebszellen effektiver zu erkennen und zu zerstören. Aktuell befinden sich mehrere tausend CRISPR/Cas-basierte Gentherapien in der klinischen Zulassungsphase.

CRISPR/Cas fängt also gerade erst an viele Bereiche unseres Lebens zu verändern.

Kann jeder jetzt Gene verändern?

CRISPR/Cas wird gerne als extrem einfaches Werkzeug beschrieben, mit dem jeder in seiner Küche die Gene von Menschen und anderen Organismen verändern kann. So einfach ist es natürlich nicht. Zum einen ist das „Einfach“ eines Molekularbiologen oft alles andere als einfach und erfordert neben viel Wissen auch immer noch spezielle Geräte und Chemikalien, die sich in einer normalen Küche nicht finden lassen.

Zum anderen ist es eine Sache, einen einzelligen Organismus oder eine Keimzelle einer Maus zu verändern. Es ist aber eine ganz andere gezielt eine Gruppe von Zellen oder gar alle Zellen in einem fertigen vielzelligen Organismus wie einem Menschen zu verändern. Die einzigen Gewebe im menschlichen Körper, an die wir aktuell einigermaßen effektiv mit Gentherapien heran kommen sind die Leber, das Knochenmark und das Auge.

Zur Veranschaulichung, dass es nicht so einfach ist wird in diesem Diagramm dargestellt, wie der Arbeitsablauf zur für eine einzige genetische Modifikation in der sehr einfachen einzelligen Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae aussieht. Hierbei wird das System und auch verschiedene Abbildungen des Ellis Lab genutzt.

Schematischer Ablauf eines CRISPR/Cas-Experiments mit Hefe, verändert nach Ellis

Kann man Altern verhindern?

| Veröffentlicht am | Keine Kommentare |

Kann man Altern verhindern? Graustufenfoto eines älteren Mannes, der vor der analogen Wanduhr nachdenkt
Kann man Altern verhindern? Foto von Brett Sayles auf Pexels.com

Können wir das Altern verlangsamen oder sogar umkehren?

Die gute Nachricht ist, das Altern zu verlangsamen und mehr als zehn Jahre zu gewinnen, ist absolut möglich und kostet dich nichts außer etwas Disziplin (ja, ich weiß, das ist die schlechte Nachricht). Um dich aber bei der Stange zu halten, werde ich erst etwas später erzählen wie. Kann man Altern verhindern? Das ist aktuell das Thema vieler Forscherinnen und Forscher.

Wie kann man altern messen?

Aber fangen wir am Anfang an. Wenn wir etwas behandeln möchten, müssen wir es zuerst klar definieren. Die offensichtlichste Definition für das Altern ist chronologisch. Die Veränderung des tatsächlichen Zeitflusses fällt jedoch eher in den Bereich der Physik und ist wahrscheinlich nicht sehr praktisch. Was wir beeinflussen wollen, ist das biologische Alter. Um dies zu messen, verwenden wir viele verschiedene Methoden, die als „Uhren“ bezeichnet werden. Sie arbeiten mit Blutparametern, Herzfrequenzvariabilität, Epigenetik, einfachen Fotos des Gesichts oder anderen Daten. Diese Uhren sind alle in gewisser Weise mit dem chronologischen Alter korreliert, können die aber im sagen, wie ein oder mehrere Aspekte deines biologischen Alters im Vergleich zu durchschnittlichen Personen deines Alters sind. Sie sagen dir also, ob du jünger oder älter bist, als du tatsächlich bist.

9 Kennzeichen des Alterns auf zellulärer Ebene
Die Kennzeichen des Alterns CC von Rebelo-Marques 2018

Was ist Altern?

Die spezifischen unangenehmen zellulären Auswirkungen des Alterns werden als die 9 Kennzeichen (Hallmarks) des Alterns zusammengefasst. Ich werde nicht ins Detail gehen, aber sie sind alle miteinander verbunden und führen zu dem, was wir als Alterung erkennen, wie Falten, graue Haare, Verlust von Muskelmasse, Gebrechlichkeit, Demenz, abnehmende Knochendichte und all die anderen Dinge, die du nicht gerne haben willst.

Wenn du diese Liste liest, errätst du vielleicht schon, warum die Behandlung des Alterns andere Vorteile haben könnte, als nur länger zu leben. Die größte Errungenschaft, nicht nur für den Einzelnen, sondern auch für die Gesellschaft, wäre die Erhöhung der sogenannten Gesundheitsspanne. Man kann argumentieren, dass während wir in den letzten 100 Jahren die durchschnittliche Lebensdauer bereits mehr als verdoppelt haben, die Gesundheitsspanne, also die Zeit, die in guter Gesundheit gelebt wird, nicht entsprechend gewachsen ist. Unsere derzeitige Medizin ist sehr gut darin geworden, die meisten der unzähligen Beschwerden zu behandeln, die das Alter mit sich bringt. Viele werden aber mehr verwaltet als geheilt. Wäre es also nicht besser (und übrigens auch billiger), die zugrunde liegende Ursache der meisten Krankheiten zu behandeln, anstatt jede von ihnen einzeln? Die Ergebnisse der Healthspan-Forschung könnten die Medizin revolutionieren und uns in die Lage versetzen, anstatt das zu reparieren was kaputt ist, zu verhindern, dass es überhaupt kaputt geht.

Anpassung der Ernährungs- und Lebensgewohnheiten

Aber wie weit sind wir? Werden wir noch alt wie unsere Großeltern? Das kommt darauf an. Um einen der führenden Köpfe auf diesem Gebiet der Wissenschaft, Professor David Sinclair, zu zitieren: „Es ist einfach, seine Lebensspanne zu verlängern. […] Wenn Sie die richtigen Dinge tun, nämlich: Essen Sie nicht zu viel, essen Sie tagsüber seltener, machen Sie etwas Bewegung, rauchen Sie nicht, trinken Sie nicht! Allein das gibt Ihnen, verglichen mit Leuten die das nicht tun, 14 zusätzliche Jahre. Es ist also nicht schwer, länger zu leben, es braucht nur etwas Disziplin.“
Nun, ich habe ja gesagt, es ist nicht allzu einfach, aber es ist machbar.

Vor allem der Teil mit dem weniger häufig Essen scheint wichtig zu sein. Intervallfasten (am besten mehr als 16 Stunden am Stück komplett ohne Nahrung) gibt den Zellen ein Gefühl von Nahrungsknappheit und schaltet bestimmte Überlebensprogramme ein. Die wahrscheinlich wichtigste ist die Autophagie, bei der die Zellen angesammelte Proteine und andere Reserven recyceln. Diese Art des Aufräumens hilft, Dinge loszuwerden, die Probleme verursachen können, wenn sie sich ansammeln.

Der andere Haupteffekt ist eine Verringerung des Stoffwechsels und insbesondere der Zellteilung. Da die Zellteilung auf mehreren Ebenen der Hauptgrund für Mutationen (Fehler in der DNA) ist, ist sie auch der Hauptgrund für das Altern. Die Vermeidung starker Mutagene wie Rauchen, übermäßiges Trinken (ein alkoholischer Standarddrink pro Tag scheint positiv zu wirken) und Sonnenbaden ist aus dem gleichen Grund hilfreich.

Es wurde auch gezeigt, dass ausreichend Schlaf und etwas Bewegung das Altern in Studien am Menschen positiv beeinflussen.

Die Alternsforschung enthält jedoch offensichtlich mehr als die typischen Ratschläge zu einem gesünderen Lebensstil.

Vom Altern zur Krankheit und mögliche Eingriffspunkte
Verschiedene Zeiten für Interventionen, um Krankheit und Tod durch Altern zu verzögern, Abbildung CC von Douglas R Seals, 2014

Nahrungsergänzungsmittel und Medikamente

Zunächst einmal gibt es Medikamente und Nahrungsergänzungsmittel, die (zumindest im Tiermodell) ein enormes Potenzial für weitere gesunde Jahre aufweisen, wie Nicotinamid-Mononukleotid (NMN), α-Ketoglutarat (AKG), Resveratrol, Metformin und Rapamycin. Ich werde jetzt nicht ins Detail gehen, aber ich werde bald einige genaueres über einige davon hier schreiben.

Die meisten von ihnen scheinen jedoch hauptsächlich als Vorbeugung und nicht als Heilung zu wirken. Und während sie in Tiermodellen vielversprechend wirken, sind bisher zuverlässige Daten an Menschen rar. Die meisten von ihnen arbeiten durch die Nachahmung des Hungersignals, das auch durch Fasten erreicht werden kann.

Senolytics

Aber es sind noch andere Maßnahmen in der Pipeline. Eine interessante Idee sind die sogenannten „Senolytics“.
Anstatt sich selbst zu töten, wie es beschädigte Zellen normalerweise tun, werden einige seneszent. Seneszenz tritt auf, wenn Zellen eine Instabilität ihrer Chromosomen bemerken. Diese tritt auf, nachdem sie sich eine bestimmte Anzahl von Malen geteilt haben oder durch bestimmte Stressfaktoren (aufgrund ihrer Telomere), so dass sie dauerhaft aufhören, sich zu teilen. Seneszente Zellen geben auch Signale ab, die zu Entzündungen führen und die Entwicklung ihrer umgebenden Zellen und der extrazellulären Matrix verändern.

Je mehr seneszente Zellen in einem Organ sind, desto weniger vital und funktional wird das Organ. Senolytics wie Dasatinib und Quercetin sind Substanzen, die diese seneszenten Zellen angreifen und entfernen, um das Organ zu verjüngen. Es gibt laufende klinische Studien an menschlichen Patienten mit diesen Substanzen zu mehreren altersbedingten Krankheiten, und erste Ergebnisse sind vielversprechend. Es gibt aber noch viel zu tun.

Zelluläre Reprogrammierung

Die Idee, die wahrscheinlich am unmöglichsten klingt, aber das Potenzial hat, die Uhr des Alterns nicht nur zu verlangsamen, sondern tatsächlich das Altern umzukehren, ist die zelluläre Reprogrammierung. Jede Zelle in unserem Körper hat im Grunde die gleiche genetische Information, die gleichen Konstruktionspläne: Unsere DNA, die in Chromosomen organisiert ist. Aber woher weiß eine Zelle in deinem Gehirn, dass sie sich nicht in deinem Fuß befindet und sich anders verhalten muss? Und, was noch wichtiger ist, woher weiß eine Zelle, dass sie sich nicht so oft wie möglich selbst kopieren oder versuchen soll, einen neuen kompletten Klon von dir zu bauen? Die Antwort ist Epigenetik (zumindest meistens). Die Epigenetik ist ein recht junges Feld, das in den letzten 15 Jahren große Fortschritte gemacht hat. Die Epigenetik bestimmt, welche Gene durch Modifikation der DNA oder der mit der DNA assoziierten Proteine ein- und ausgeschaltet werden. Diese Lesezeichen sorgen dafür, dass sich eine Zelle so verhält, wie sie es tut. Sie werden durch Umwelteinflüsse wie Sonnenschein, Rauchen, Essen, kein Essen oder tausend andere Dinge verändert. Die meisten dieser Faktoren und die Zeit selbst führen zu einer allgemeinen Abnahme dieser Lesezeichen. Obwohl bestimmte Bereiche des Genoms mit der Zeit auch mehr von ihnen bekommen. Die Idee ist also, diese Lesezeichen auf einen „jüngeren“ Zustand zurückzusetzen.

Yamanaka Faktoren

Im Jahr 2006 wurde eine Reihe von vier Transkriptionsfaktoren (Regulatoren für Gene) identifiziert, die eine differenzierte Zelle von einem Teil eines bestimmten Gewebes in einen sehr ähnlichen Zustand zurückversetzen können, wie die Zellen, die man in einem Embryo findet. Die mit den Transkriptionsfaktoren behandelten Zellen werden zu Stammzellen und können in nahezu jeden Zelltyp im Körper umprogrammiert werden. Diese Transkriptionsfaktoren werden nach einem der Autoren dieser Studie aus dem Jahr 2006 Yamanaka-Faktoren genannt. Unter Verwendung der Yamanaka-Faktoren gab es erfolgreiche Reprogrammierungsstudien an Tieren. Ziel ist es, die Epigenetik der Zellen auf jung zurückzusetzen, ohne die Zellen zu dedifferenzieren, wodurch die Gewebe, die sie bilden, auseinanderfallen und Tumore entstehen würden. Diese Technik wird derzeit bei Primaten getestet, nachdem bereits sie erfolgreichen an Mäusen erprobt wurde. Ziel der aktuellen Studien ist es das Sehvermögen der Tiere wiederherzustellen, die aufgrund eines Glaukoms erblindet sind. Die Gruppe von David Sinclair, die diese Experimente durchführt, geht davon aus, dass sie noch in diesem Jahr für klinische Studien am Menschen bereit sein wird. Gelingt dies, wäre es für viele blinde Menschen eine neue Hoffnung und ein Proof of Concept zur Verjüngung eines Gewebes durch epigenetische Reprogrammierung.

Dies ist jedoch eine sehr ehrgeizige Zeitplanung und ich wage zu behaupten, dass dies nicht passieren wird. Der Hauptgrund dafür ist, dass die hier verwendeten Yamanaka-Faktoren zu den stärksten Onkogenen gehören, die man kennt. Das sind Gene, die für die Umwandlung einer Zelle in eine Krebszelle verantwortlich sind. Es ist zu erwarten, dass Therapien, die auf einem schmalen Grat zwischen Dedifferenzierung und Krebs arbeiten, von den Behörden mit äußerster Sorgfalt geprüft werden, bevor sie für Studien am Menschen akzeptiert werden.

Darstellung der Entnahme von Patientenzellen, Umwandlung in Stammzellen, Reprogrammierung und Injektion zur Behandlung von Erkrankungen
Herstellung und Verwendung von induzierten Stammzellen aus einer Patientenbiopsie zur Heilung genetischer oder anderer Krankheiten oder sogar zur Umkehrung des Alterns, Illustration CC von Manal Hadenfeld, 2020

Eine mögliche zukünftige Anwendung könnte darin bestehen, die Zellen eines Patienten außerhalb des Körpers zu Stammzellen zu behandeln und sie dann zu injizieren, um beschädigtes Gewebe zu regenerieren oder den Patienten als Ganzes zu verjüngen.

Kann man altern verhindern?

Ist es also möglich? Kann man Altern verhindern? Bisher kann man es nur verlangsamen, aber viele Forscher Arbeiten daran die Grundlagen zu entschlüsseln und das Altern zu besiegen.

Vieles ist unklar über die Möglichkeit zur Umkehrung des Alterns. Viele Studien auf diesem Gebiet zeigen widersprüchliche Ergebnisse, aber was vor 20 Jahren unmöglich schien, entwickelt sich rasant von vielversprechender Grundlagenforschung zu klinischen Studien. Derzeit brauchst du noch etwas Disziplin und Änderungen an deinem Lebensstil um länger zu leben und deine Gesundheitsspanne zu erhöhen. Je mehr Lebens- und Gesundheitszeit du aber dadurch gewinnst, desto näher könnten Wissenschaftler an echten Lösungen für alle unangenehmen Auswirkungen des Alterns und vielleicht des Alterns selbst sein.

Dieser Beitrag wurde zunächst als Gastbeitrag im Blog BoldedScience.com veröffentlicht und seitdem geändert, übersetzt und aktualisiert.

Wie funktioniert Genmanipulation?

| Veröffentlicht am | 2 Kommentare |

Der nächste Schritt um Hefe das Altern beizubringen

Leicht dramatisierte Darstellung von mir mit Pipette, Petrischale und Blitzen
Foto von mir, wie ich die Gene einer wehrlosen Hefe verändere, eigene Arbeit

Im letzten Artikel hatte ich am Ende ein DNA-Fragment, das ich mit einer PCR hergestellt habe. Jetzt muss ich diese DNA in meine Hefezellen bekommen, um ihnen beizubringen, wie normale Menschen zu altern. Ich muss Sie also genetisch manipulieren. Das nennt man auch Transformation. Aber wie funktioniert Genmanipulation?

Wie funktioniert Genmanipulation?

Es gibt verschiedene Transformationstechniken, aber am häufigsten sind Elektroporation und chemische Transformation. Man kann emotionale Debatten auslösen, wenn man fragt, was besser ist. Die häufigere und im Allgemeinen etwas einfachere ist aber die chemische Transformation. Das ist auch die Methode, die ich für meine Hefe gewählt habe.

Hindernisse für DNA auf dem Weg in die Zelle

Was bei der Transformation mechanisch genau passiert ist nicht vollständig verstanden. Die Hauptidee ist, dass die DNA, die ich in die Zelle bringen will, die Barrieren überwinden muss, die Zellen vor ihrer Umgebung schützen. Diese Barrieren sind die Zellwand (für alle außer tierischen Zellen, die keine haben) und die Zellmembran. Die Hauptaufgabe der Zellwand ist die mechanische Stabilität. Du kannst sie Dir wie einen Stahlrahmen vorstellen, der verhindert, dass die Membran zu stark anschwillt und platzt. Die Zellmembran kannst du dir wie eine Wasserbombe vorstellen. Auf molekularer Ebene ist es ein relativ breites Netz, also keine physikalische Barriere für die DNA-Moleküle. Problematisch ist aber, dass es elektrisch geladen ist. DNA ist negativ geladen und würde von den meist ebenfalls negativ geladenen Molekülen in der Zellwand abgestoßen werden. Dieses Hindernis wird überwunden, indem positiv geladene Ionen hinzugefügt werden, die die Ladungen der Zellwand neutralisieren und es der DNA ermöglichen, sich der Zellmembran zu nähern.

Darstellung einer Hefezelle bei der Abspaltung einer Tochterzelle. Zu sehen sind die wichtigsten Organellen. Die Zellmembran und Zellwand sind an einer Stelle vergrößert um den genauen Aufbau darzustellen. Man sieht die Lipiddoppelschicht der Zellmembran und das grobe Netz aus Proteinen und Zuckern, dass die Zellwand bildet.
Schematische Struktur einer knospenden Hefezelle mit besonderem Fokus auf Membran und Zellwand rechts, Giulia Coradello, 2021

Die Zellmembran

Aber dann gibt es noch ein anderes Problem: Die Zellmembran. Die Membran ist eine Doppelschicht aus Lipiden, also Fettmolekülen, die einen polaren Kopf und einen ungeladenen Schwanz haben. Diese Struktur ist so etwas wie eine zweidimensionale Flüssigkeit. Sie ist relativ elastisch und ermöglicht es ungeladenen Molekülen, die nicht zu groß sind, relativ frei durchzuschlüpfen. Dazu gehört zum Beispiel Wasser. Da DNA riesig und geladen ist, wird sie normalerweise nicht einfach durchkommen. Um diese Barriere zu überwinden, musst ich die Hefe ein wenig quälen (*böses Wissenschaftlerlachen). Ich packe Sie plötzlichen von Raumtemperatur auf 42 °C. Klingt nicht so schlimm, aber Hefe mag es am liebsten zwischen 20 und 30 ° C. Temperaturen über 40 ° C beginnen sie langsam zu töten. Es wird angenommen, dass dies Druckunterschiede zwischen der heißen Außenseite und der Kühle im Inneren der Zelle aufbaut, die durch die Bildung von Poren in der Membran ausgeglichen werden. Durch diese Poren kann nun die DNA in die Zelle eindringen.

Die letzte Verteidigungslinie

Die letzte Verteidigungslinie der Zelle sind Enzyme, die DNA essen. Um sie zu überwinden füge ich etwas Träger-DNA hinzu, die zuerst gegessen wird und so die DNA schützt, die ich in die Zellen bekommen möchten. Als Träger-DNA verwendet man normalerweise Lachssperma, das man kocht und dann der Mischung hinzufügt. Wenn du also Molekularbiologen über das Kochen von Sperma sprechen hörst, ist es wahrscheinlich nicht so seltsam, wie es klingt.

Wie was passiert mit der fremden DNA in der Zelle?

Nachdem wir die Abwehr überwunden haben, haben wir jetzt viele tote Zellen, viele die nichts oder nur die Träger-DNA aufgenommen haben, aber wir haben hoffentlich auch einige, die die DNA haben, die wir einschleusen wollen. Was mit dieser DNA passiert, hängt von ihrer Form ab. Wenn es sich um einen geschlossenen Kreis handelt und einige spezielle Signale in den Code enthalten sind, wird er in der Zelle behalten und in die Tochterzellen kopiert, wenn sich die Zelle teilt. Dies wird als Plasmid bezeichnet und ist gut, wenn du Gene nur vorübergehender einführen möchtest, ohne das Genom dauerhaft zu verändern. Wenn die DNA (wie in meinem Fall) ein lineares offenes Molekül ist, das durch eine PCR produziert wurde und Enden hat, die einer Sequenz im Genom der Hefe ähneln, kann sie in den Zellkern gelangen, wo das Genom aufbewahrt wird. Dort kann es einspringen, während die Zelle Ihr Genom verdoppelt und dauerhaft in das Genom integriert werden. Das nennt man Rekombination. Bei Hefe funktioniert das Ziemlich gut, aber trotzdem nur etwas bei einer von einer Million Zellen.

Die richtige Finden mit dem gläsernen Schuh

Jetzt müssen wir also etwas machen, was ja bekanntlich für viele Wissenschaftler schwer ist: Die richtige finden. Zum Glück haben wir etwas wie einen gläsernen Schuh, der nur den Zellen passt, bei denen die Integration, also die Genmanipulation geklappt hat.

Man nennt das Selektion. Wir säen die Zellen auf ein Medium, in dem nur die Zellen wachsen können, die unsere DNA aufgenommen und integriert haben, also denen der Schuh passt. Um das zu erreichen, fügt man der DNA, die man einschleust einen Marker hinzu. Das ist ein Gen, das die Zellen entweder resistent gegen etwas macht, das für die anderen giftig ist oder das sie von einer Nahrungsquelle leben lässt, die die anderen nicht verwenden können. Ich habe Zellen verwendet, die normalerweise Uracil (das ein Teil der DNA ist) nicht selbst herstellen können, so dass sie nicht auf einem Medium wachsen können, auf dem es kein Uracil gibt. Sie können auf diesem Medium nur wachsen, wenn sie mein Konstrukt eingebaut haben, das ein Gen enthält, das ihnen hilft, ihr eigenes Uracil herzustellen.

Das Problem ist, dass diese Integration sehr selten ist. Du beginnst mit einer riesigen Menge an Zellen, transformierst sie alle, packst sie auf die Auswahlplatte und bekommst manchmal nichts, manchmal ein oder zwei Kolonien, aber manchmal, wenn du Glück hast, bekommst du auch so etwas wie 100.

Wie funktioniert Genmanipulation? Agarplatten auf die die transformierte Hefe ausgesät wurde. Auf einigen sind zwischen 1 und 100 weiße Punkte zu erkennen. Das sind Kolonien der erfolgreich genmanipulierten Hefen.
Wie Selektionsplatten der verschiedenen transformierten Stämme und eine Kontrolle, die nicht transformiert wurde, eigene Arbeit

Der letzte Schritt, wieder eine PCR

Um zu überprüfen, ob das Konstrukt wirklich dort integriert ist, wo ich es mir erhofft habe, brauche ich jetzt eine weitere PCR. Ich habe Primer gewählt, die normalerweise ein kurzes DNA-Fragment aus der Region produzieren, in die ich mein Konstrukt integrieren möchte. Wenn es erfolgreich integriert wird, wird das Fragment länger, was ich in einer Gelelektrophorese, die die Fragmente nach der Größe auftrennt, sehen kann. Und das ist es, was ich gerade tue. Ich gebe bald ein Update, wenn ich endlich meine alternde Hefe gefunden habe.

Wie funktioniert Genmanipulation? Man nimmt ein Stück DNA, bringt es dazu sich ganz nah an die Zellen zu kuscheln, macht sie heiß und sucht dann mit einem gläsernen Schuh die richtige. Wer hätte gedacht, dass Genmanipulation so romantisch ist.

Was ist eine PCR?

| Veröffentlicht am | Keine Kommentare |

Und wie funktioniert sie?

Was ich machen will

Im letzten Artikel habe ich dank Prof. Yu Fu ein Stück DNA bekommen, dass ich als Schablone für meine Arbeit nutzen kann. Auf diesem DNA-Ring, den man Plasmid nennt, sind verschiedene Funktionen eingebaut, dank derer er sich in Hefe und E. coli Bakterien halten und vermehren kann. Was mich aber vor allem Interessiert ist die „Nutzlast, die er enthält“: Ein Promoter, der die Funktion von Genen steuert. Was ich damit will erkläre ich in einem älteren Artikel, den ich aber bisher noch nicht übersetzt habe (Ich mache das bestimmt noch und es gibt schon eine etwas holprige automatische Übersetzung).

Kurz gesagt ich möchte die original Steuerung von einem Gen (Telomerase) austauschen gegen eine, die ich an und aus schalten kann. Das heißt, ich möchte, dass ein Stück der Sequenz von dem DNA-Ring (der Promoter) eine bestimmte Stelle des Genoms (also der Erbinformation) der Hefe ersetzt. Dazu muss ich zwei Sachen erledigen bevor ich die Information in die Hefe bringen kann:

Ich muss aus dem DNA-Ring, das Stück dass ich brauche als lineares DNA-Fragment (nicht mehr Ring) rausholen und ich muss an dieses Fragment an beiden Enden Stücke anhängen, die genau den Stellen im Genom der Hefe entsprechen an denen ich es einfügen will.

Was ist eine PCR?

Ich kann beides in einem Schritt mit einer Technik namens Polymerase-Kettenreaktion oder PCR machen. Aber was ist eine PCR?

Eine PCR ist eine Methode, um DNA zu produzieren, ohne lebende Zellen dafür zu benutzen. Es ist so etwas wie eine molekulare Kopiermaschine. Die Hauptbestandteile für eine PCR sind ein Enzym namens DNA-Polymerase (der eigentliche Kopierer), dNTPs (die die Bausteine der DNA), eine DNA-Vorlage (oder Template), aus der ich kopieren möchte und Primer. Primer sind kleine DNA-Stückchen (normalerweise etwa 20-25 Basen lang), die den DNA-Abschnitt definieren, der kopiert wird. Der Vorwärtsprimer (das Startsignal) ist komplementär zu der Sequenz, bei der ich die Kopie starten möchte und der Rückwärtsprimer ist identisch mit der Sequenz, an der ich die Kopie stoppen möchte.

Schematische Darstellung einer PCR mit einfachen Bausteinen als DNA
Was ist eine PCR? Das blaue Template wird in Einzelstränge aufgeschmolzen, die pinken Primer heften sich an Ihre Gegensequenzen auf dem jeweiligen Strang, die braune Polymerase verlängert die Primer entlang des Strangs indem sie die jeweils komplementären dNTPs anbaut, der Vorgang wir wiederholt, wobei sich bei jedem Durchgang die Zahl der Fragmente, die zwischen den Primern liegend verdoppelt, also exponentiell wächst. CC BY-SA 4,0

Wie funktioniert eine PCR? Die drei Schritte

Das Bild oben stammt aus dem Wikipedia-Artikel über PCR, der die Methode auch sehr gut im Detail erklärt. Im ersten Schritt muss die DNA für das Kopieren zugänglich gemacht werden, indem sie erhitzt wird bis sich die typische Doppelstrangstruktur in zwei Einzelstränge aufspaltet. Dazu erhitzt man sie auf etwa 95 °C.

Als zweites kühlt man die DNA auf die Annealing-Temperatur ab. Das ist die Temperatur, bei der die Primer sich an die Vorlage anheften können. Sie ist also etwas kälter als die Schmelztemperatur der Primer und hängt von der länge und Zusammensetzung der Primer ab. Meistens liegt sie zwischen 50 und 60 °C.

Im dritten Schritt muss die DNA-Polymerase gestartet werden. Die meisten Polymerasen, die man für PCR benutzt arbeiten am besten um die 72 °C. Das klingt nach einer sehr hohen Temperatur für ein Enzym und das ist es auch. Der Trick ist, dass die Polymerase aus dem Bakterium Thermophilus Aquaticus (oder anderen hitzliebenden Bakterien) stammt, das um hydrothermale Quellen herum lebt, die Wasser, Rauch, Säure und anderes Zeug bei Temperaturen von mehr als 100 ° C spucken. Deshalb sind ihre Enzyme optimiert, um unter extrem heißen und unangenehmen Bedingungen zu arbeiten.

Jetzt wiederholst du diese drei Schritte immer und immer wieder und mit jeder Wiederholung verdoppelt sich die Anzahl deiner Kopien des DNA-Stücks, das zwischen den beiden Primern liegt. Das bedeutet, dass Sie ein exponentielles Wachstum von 1 zu 2 zu 4 zu 8 zu 16 haben … auf etwas mehr als eine Million nach 20 Zyklen auf etwas mehr als eine Milliarde nach 30 Zyklen. So erzeugt man in recht kurzer Zeit (normalerweise 1 bis 4 Stunden) eine Menge identischer DNA.

Die Maschine, die die Temperatur programmiert einstellt, heißt Thermocycler und sieht recht unspektakulär aus.

Ein typischer Labor-Thermocycler von Eppendorf, eigene Arbeit

Zusatzfunktionen des Kopierers

Dies erklärt, wie ich den DNA-Abschnitt aus dem Plasmid kopiere. Aber ich wollte auch eine Sequenz an den Enden hinzufügen. Das ist eigentlich ganz einfach. Ich füge die Sequenz einfach zu den Primern hinzu, weil sie der Anfang und das Ende meiner neu kopierten DNA-Konstrukte werden.

Jetzt fragt Ihr euch vielleicht, wie diese Primer bekomme? So wie die meisten Dinge heute. Ich bestelle sie online. Es gibt Unternehmen, die sich auf die Herstellung von kundenspezifischer DNA spezialisiert haben. Grundsätzlich könnte ich mir auch die ganze Arbeit sparen und einfach mein ganzes Konstrukt online bestellen, aber das ist immer noch ziemlich teuer. Während meine außergewöhnlich langen Primer (Primer + Sequenz sind etwa 120 Basen lang) etwas zwischen 100 und 150 € kosten, würde mein gesamtes 2500 Basen langes Konstrukt über 1.000 € kosten. Das ist immer noch ein ziemlicher Unterschied, aber es wird billiger und in ein paar Jahren werden Biologen wahrscheinlich viel mehr DNA bestellen, als sie mit molekularen Techniken wie PCR und Klonen zu erzeugen.

Wie überprüfe ich ob es geklappt hat?

Jetzt, wo ich mein PCR-Produkt habe, möchte ich überprüfen, ob es auch das richtige ist. Der einfachste Weg ist den ganzen PCR-Ansatz in ein Gel zu packen, das kurze DNA schneller passieren lässt als lange DNA. Dann legt man eine Spannung an und die negativ geladene DNA wandert in Richtung der positiven Elektrode und teilt sich nach Größe auf. Wenn man außerdem einen Marker in das Gel packt, der DNA-Stücke in bekannter Größe und einen Stoff enthält, die DNA unter UV-Licht sichtbar macht (Ethidiumbromid), kann man sehen, welche Größe unsere kopierten Fragmente haben. Das gibt uns normalerweise eine gute Vorstellung davon, ob das Experiment wie erwartet gelaufen ist.

Agarose Gel Elektrophorese zur Trennung der DNA nach Größe und Überprüfung der PCR-Ergebnisse, eigene Arbeit

Klappt das immer?

Ich habe das alles gemacht und beim ersten Versuch war das Ergebnis überhaupt keine sichtbare DNA. Dann habe ich ein paar Parameter verändert und es nochmal versucht. Diesmal war zumindest eine sehr dünne Bande zu sehen, wo ich sie erwartet hatte und ein paar andere, wo sie nicht sein sollten. Also habe ich noch ein paar Parameter geändert und beim dritten Versuch bekam ich dieses wunderbare Bild von einem Gel mit einer starken Bande genau an der Position, an der ich es erwartet hatte.

Bild einer Gelelektrophorese eines PCR-Produktes, links von einer speziellen Gelkamera, rechts das Gel auf dem UV-Tisch mit der Handykamera, eigene Arbeit

Das hat mich ziemlich glücklich gemacht, aber jetzt muss ich etwas damit anfangen. Ich will diese DNA in eine Hefezelle stecken und in das Genom integrieren. Das wird Genmanipulation oder Transformation genannt und ist auch ziemlich schwierig.

Hefe beibringen, wie normale Menschen zu altern Teil III

| Veröffentlicht am | Keine Kommentare |

Hefezellen, die auf einem selektiven Teller wachsen, eigene Arbeit

Im Beitrag "Hefe beibringen, um Teil II zu altern" habe ich erklärt, was ich zuerst versucht habe, meiner Hefe beizubringen, ihre Telomere bei jeder Zellteilung zu verkürzen. Ich habe Ihnen auch gesagt, dass es noch nicht funktioniert hat. Obwohl ich die Tretrad-Dissektion noch nicht ganz aufgegeben habe, habe ich mich entschieden, zuerst einen anderen Weg zu versuchen. Es wäre schon schön, meine fluoreszierend markierten Zellen mit einer ausgeschalteten Telomerase zu haben, aber es wäre viel cooler, die Telomerase nach Belieben ein- und ausschalten zu können.

Ein- und Ausschalter an der Wand
Foto von Mikhail Nilov auf Pexels.com

Die Art und Weise, wie ich versuche, dies zu erreichen, wird Promoter Shuffle genannt. Wie Sie vielleicht wissen, werden Proteine (wie die Untereinheit der Telomerase, an der ich interessiert bin) im Genom durch einen festen Code kodiert, bei dem 3 Buchstaben (Codon genannt) in der DNA (Basen) in einen Buchstaben im Protein (Aminosäure) übersetzt werden. Dieser Code ist bekannt und verstanden. Alle Codes für Proteine beginnen mit dem gleichen Startcodon und enden mit einem von drei Stop-Codons. Um dieses Protein jedoch wirklich in der Zelle zu produzieren, muss es mehr geben. Flankiert werden muss das Gen von einem regulatorischen Code, der beeinflusst, ob und wie stark das kodierte Protein produziert wird. Am wichtigsten dafür ist die sogenannte Promoter-Region. Dies ist der Code direkt vor dem Startcodon. Es ist normalerweise zwischen 50 und ein paar hundert Basen lang. Ihr Code ist viel weniger verstanden als der für das Protein. Es gibt starke und schwache Promotoren, Promotoren, die immer aktiv sind und Promotoren, die bei bestimmten Reizen aus- oder eingeschaltet werden.

Da ich die Telomerase umschaltbar machen möchte, nehme ich den genetischen Code für eine ihrer Untereinheiten und tausche einen Teil des Codes vor seinem Startcodon gegen etwas anderes aus. Es gibt eine Handvoll gängiger schaltbarer Promotoren in Hefe, die gut beschrieben sind, aber die meisten von ihnen haben einige Nachteile. Ich habe eine relativ neu identifizierte identifiziert, von der ich hoffe, dass sie eine gute Wahl sein wird.

Es ist der Promotor des Gens DDI2, der normalerweise fast inaktiv ist, aber seine Aktivität um mehr als das 1000-fache erhöht, wenn die Zellen mit dem chemischen Cyanamid inkubiert werden. In der Konzentration, in der es hier verwendet wird, hat Cyanamid fast keine Wirkung auf die Hefezellen.

Der Austausch von Code im Hefegenom ist glücklicherweise nicht allzu kompliziert. Hefe enthält ziemlich leicht genetisches Material, das Sie füttern, wenn eine Dehnung am Anfang und Ende des eingefügten Codes mit dem Code im Genom übereinstimmt. Dieser Prozess wird als Rekombination bezeichnet. Rekombination ist auch der Prozess, der Kinder einzigartig macht, anstatt Kopien ihrer Eltern, weil es zufällig das genetische Material Ihrer Eltern mischt, das an Ihre Kinder weitergegeben wird.

Ich brauche also einen DNA-Abschnitt, der die 500 Basen vor dem Startcodon von DDI2 mit 50 Basen an beiden Enden aus dem Bereich vor dem Startcodon der Telomerase-Untereinheit enthält. Ich habe viel darüber nachgedacht, wie ich das selbst bauen kann, aber es wäre eine Menge Arbeit gewesen. Dann dachte ich an die Zeitung, in der ich zum ersten Mal über den DDI2-Promoter las. In dem Nature-Artikel "Fine-tuning the expression of target genes using a DDI2 promoter gene switch in angehender Hefe" charakterisierten Professor Yu Fu von der Chinesischen Akademie der Wissenschaften und Kollegen den Promotor und erklärten, wie sie ihn an genomischen Stellen integrierten.

Also schrieb ich einfach eine E-Mail an Professor Fu und fragte, ob ich etwas von dem Material bekommen könnte, das sie benutzten. Er antwortete tatsächlich innerhalb eines Tages und sagte, dass er mir gerne helfen würde. Er schickte mir den Code des Promoters, ohne eine Gegenleistung zu erwarten. Das ist eine großartige Sache an der Wissenschaftsgemeinschaft. Die meisten Leute teilen gerne und sind wirklich nett, wenn Sie Interesse an ihrer Arbeit zeigen.

Alles, was ich jetzt tun muss, ist, die Code-Strecken an den Enden hinzuzufügen, die das Ziel bestimmen, wo ich es integrieren möchte. Ich mache das mit einer PCR, die ich in meinem nächsten Artikel erklären werde.

Soziale Medien für die Wissenschaft

| Veröffentlicht am | Keine Kommentare |

Schaltfläche "Apps verwischen" schließen
Foto von Pixabay auf Pexels.com

Es ist ungefähr zwei Wochen her, seit ich angefangen habe, diesen Blog aktiv zu nutzen, und wie Sie wahrscheinlich gesehen haben , war ich beschäftigt. Während ich diesen Blog begann, begann ich auch darüber nachzudenken, wie ich die Leute dazu bringen kann, ihn zu lesen. Die offensichtlichste Antwort ist Social Media. Social-Media-Kanäle sind so konzipiert, dass sie Menschen ansprechen und ihnen zeigen, was Sie interessant finden. Lange Zeit nutze ich Facebook nur für private und LinkedIn nur für geschäftliche Zwecke. Ich habe Twitter nie wirklich benutzt, weil ich immer dachte, dass es hauptsächlich eine Plattform ist, auf der Politik und Medien Ansichten austauschen und so tun, als wären sie die Öffentlichkeit.

Dann hatte ich ein Seminar über Wissenschaftskommunikation mit Susanne Geu. Sie sagte mir, dass Twitter eine ausgezeichnete Plattform für die Wissenschaftskommunikation ist, und als ich mit dem Blog begann, begann ich auch, auf Twitter aktiv zu werden.

Nach etwa zwei Wochen aktiver Arbeit an diesem Blog und verschiedenen Social Media Kanälen habe ich folgende Entdeckungen gemacht

Wenn es um Klicks auf Ihren Blog geht, vergessen Sie Twitter. Sie können sehr schnell eine große Blase von Menschen finden, die in einem ähnlichen Bereich arbeiten, und sie schnell ansprechen (von 1 bis 70 Followern in einer Woche), aber die Leute auf Twitter mögen es kurz. Aus tausend Impressionen bekommst du ein paar hundert Interaktionen und von denen nur eine Handvoll Klicks auf deine Links. Es ist jedoch immer noch ein großartiges Werkzeug, um in Kontakt zu treten und Pointen zu kommunizieren.

LinkedIn funktioniert ungefähr so gut, wie ich erwartet habe. Da ich dort viele Kontakte habe, bekomme ich viele Likes und ziemlich viele Klicks, aber keine aktive Diskussion oder Interaktion.

Ursprünglich wollte ich Facebook privat halten, aber ich habe immer noch meinen Blog gepostet, damit Freunde sehen konnten, was ich tue, und das brachte offensichtlich etwas Ermutigung. Um Freunden, Familie und Leuten zu sagen, dass Sie wissen, was Sie tun, können Sie auch den WhatsApp-Status verwenden.

Was wirklich gut funktioniert, um Klicks, aber auch wirklich gute Diskussionen zu bekommen, sind Gruppen in Facebook. Finden Sie einige gute Wissenschaftsgruppen und posten und diskutieren Sie dort. Dies ist nicht allzu einfach, da die meisten Gruppen in Facebook entweder voller Spam oder völlig inaktiv sind, aber es gibt einige.

Ich werde in ein paar Monaten ein Update über meine Erfahrungen mit Social Media schreiben, vielleicht hat sich mein Eindruck geändert, aber bisher würde ich sagen, dass alle diese Kanäle Vorzüge und eine andere Zielgruppe haben.

Was ich noch nicht ausprobiert habe, weil ich nicht wirklich glaube, dass das mein Publikum ist, ist Instagram und TikTok. Aber vielleicht irre ich mich da, also wenn Sie eine andere Meinung zu diesen Netzwerken haben, lassen Sie es mich bitte wissen.

Wenn Sie sehen möchten, was ich auf diesen Plattformen mache, folgen Sie mir bitte auf LinkedIn oder Twitter!

Hefe zum Altern beibringen Teil II

| Veröffentlicht am | 1 Kommentar |

In meinem letzten Beitrag Ich erklärte, wie man eine Tüte mit 4 Hefesporen bekommt, von denen eine hoffentlich die beiden Mutationen hat, die ich in meinem neuen Hefestamm haben möchte. Jetzt kommt der wirklich knifflige Teil: Sie müssen diese Spore finden.

Hefezellen unter 1000-facher Vergrößerung (DIC), eigene Arbeit

Bevor ich die Methode erkläre, muss man sich ein Bild davon machen, wie klein eine Hefezelle ist. Die durchschnittliche Hefezelle beträgt etwa 3 bis 4 Mikrometer. Der kleinste Abstand zwischen zwei Punkten, um sie mit bloßem Auge noch als zwei zu sehen, beträgt 0,1 mm, was etwa dem 300-fachen einer Hefezelle entspricht. Ein menschliches Haar ist im Durchschnitt zwischen 0,06 und 0,08 mm dick, was dem 20-fachen einer Hefezelle entspricht. Wenn Sie sich das Bild oben ansehen, das Hefezellen darstellt, die 1000x vergrößert sind, ist der gesamte Rahmen etwa so dick wie ein Haar.

OK, sie sind also wirklich klein und mit bloßem Auge nicht sichtbar, aber wir wollen eine einzelne Spore finden (die wieder kleiner ist als eine normale Zelle) und sie identifizieren. Die Methode, die wir dafür verwenden, heißt Mikromanipulation. Ein Mikromanipulator ist im Grunde ein Mikroskop mit einem Tisch (auf dem Sie die Platte mit Ihren Zellen fixieren), der in winzigen Schritten bewegt werden kann. Und es hat einen Hebel mit einer sehr dünnen Glasnadel, die durch einige Mechaniken auch in einem sehr kleinen Maßstab bewegt werden kann.

Mein Labor hat einen ziemlich coolen und modernen Mikromipulator, der einen Joystick hat, um die Bühne zu bewegen, und einen Computer, der Sie zu Positionen auf einem virtuellen Gitter auf Ihrer Platte bringt, wo Sie einzelne Zellen platzieren können.
Was Sie jetzt tun, ist, dass Sie durch ein Pflaster auf Ihrem Teller schauen, wo Sie einige Ihrer Zellen platziert haben. Sobald Sie eine Tasche mit 4 Sporen (die Tetrade genannt wird) gefunden haben, bewegen Sie die winzige Nadel sehr nahe daran. Einen Moment bevor die Nadel tatsächlich die Platte berühren würde, bildet sich ein Meniskus aus Wasser zwischen der Nadelspitze und der Platte, die den Tetraden aufschöpft und hoffentlich nichts anderes. Dann bewegen Sie sich in eine leere Position auf dem Gitter und indem Sie die Nadel bewegen und schütteln, während sie fast die Oberfläche berührt, versuchen Sie, eine dieser 4 Sporen zu deponieren. Dann gehst du zur nächsten Stelle und machst das noch einmal. So bekommst du am Ende einen Teller voller 4 Spots hintereinander, wo du einzelne Sporen deponiert hast. Wie das funktioniert, sehen Sie im folgenden Video.

https://youtu.be/BRFe-L0f8sA
Ich zeige, wie eine Tetradendissektion funktioniert.

Nachdem ich die Sortierung beendet hatte, stellte ich die Platte für ein oder zwei Tage auf 30 °C, um den Zellen Zeit zum Wachsen zu geben. Das Ergebnis sieht folgendermaßen aus:

Sezierplatte mit Kolonien darauf, eigene Arbeit

Wie Sie sehen, sind nicht alle Zellen, die ich angelegt habe, gewachsen. Das ist ganz normal, denn nicht alle Sporen sind nach dem Eingriff lebensfähig. Auf der linken Seite war das Reservoir, wo ich viele Zellen platziert habe, um nach Tetraden zu suchen. Ich habe das mit einem sauberen Skalpell abgeschnitten, damit die Zellen den Rest des Tellers nicht überwachsen.

Im nächsten Schritt muss ich nun herausfinden, welche dieser Zellen wirklich von Sporen stammen (und haploid sind) und welche von ihnen eigentlich nur normale diploide Zellen sind, die versehentlich mit 3 Kumpels herumlagen und wie Tetraden aussahen. Um dies zu tun, verwenden Sie eine weitere nette Eigenschaft von Hefe. Wilde Hefe kann von einem Liter von Dingen leben und alles, was sie braucht (wie Aminosäuren und Basen für DNA), selbst entstehen lassen. Die Labstrains, die Sie normalerweise verwenden, haben jedoch einige Gene, die sie für diesen Knock-out benötigen. Dies bedeutet, dass Sie, um sie wachsen zu lassen, dem Medium einige Aminosäuren und andere Dinge hinzufügen müssen. Der Trick ist nun, dass die genetischen Merkmale, die ich hier gemeinsam züchten möchte, mit dem genetischen Code markiert sind, den der Laborstamm benötigt, um diese Amiosäuren selbst herzustellen. Das heißt, ich nehme diese Platte und stempele sie auf eine Platte, auf der dem Medium zwei spezielle Aminosäuren fehlen, nur die Zellen können wachsen, die beide genetischen Merkmale haben, die ich brauche. Dies wird als Selektion bezeichnet.

Das Problem dabei ist, dass die diploiden Zellen, die ich für Tetraden gehalten habe, auch beide Marker haben und auch wachsen können. Hier kann jedoch die Statistik helfen. Da ich immer alle 4 Zellen, die zusammen in einer Reihe waren und in einem Tetrad nur eine dieser 4 beide genetischen Marker haben kann, muss ich nun meine Selektionsplatte auf Reihen überprüfen, in denen nur eine der 4 Zellen gewachsen ist. Ein weiterer Test, den ich danach machen kann, ist zu sehen, ob sich die Zellen einer solchen Kolonie mit anderen haploiden Zellen beider Paarungstypen paaren. Diploide Zellen werden das nicht tun.

Originalplatte rechts, Auswahlplatte links, eigene Arbeit

Die Ergebnisse sehen relativ vielversprechend aus, aber weitere Analysen zeigten, dass dies tatsächlich nicht funktioniert hat. Dies ist jedoch ein wichtiger Teil der Wissenschaft: Dinge funktionieren nicht. Nachdem ich dies ein paar Mal ausprobiert hatte, beschloss ich, zuerst einen anderen Weg zu versuchen, meinen Hefezellen das Altern beizubringen, der etwas eleganter ist und hoffentlich besser funktioniert: Ich werde das Gen für Telomerase ein- und ausschalten, damit ich es nach Belieben ein- und ausschalten kann. Ich werde das nächste Mal erklären, wie das funktioniert.

Nach obenCookie Consent mit Real Cookie Banner